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应用Piggybac转座子系统,进行高表达稳定细胞株开发

时间:2023-04-24

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引言   FosterBio 

重组治疗性蛋白主要采用稳定的哺乳动物细胞系在大规模生物反应器生产所得。然而,快速高效生产这些蛋白质的主要限制之一是细胞系的构建及表征,该过程往往是较为费力和耗时的。细胞系构建主要是将基因递送到培养细胞中,大多数转染及整合方法是依赖于外源基因随机整合的。使用传统转染方法将表达质粒整合到宿主细胞基因组的高度转录活性区域的概率很低,并且绝大多数转染细胞表达的重组蛋白表达水平不足。此外,细胞在非选择性培养基中培养时,外源基因表达量会下降。因此,必须筛选大量的候选细胞系,才能获得一些高产细胞系。为提高外源基因整合效率,并筛选得到稳定细胞株,可采用PiggyBac(PB)转座子表达系统,将外源基因整合至基因组中。


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转座子简介
转座子的出现为构建基因编辑细胞株提供了一个全新的视野。转座子也被称为跳跃基因,由Barbara McClintock教授在上世纪50年代发现,是指一段DNA序列由基因组的一个位置跳跃到另一个位置。转座子主要包含两种类型:
a) I类转座子:
逆转座子(retrotransposons),自身不表达转座酶,先转录为RNA,通过RNA的反转录获得cDNA,cDNA在整合酶的作用下转移到其他基因组位置。
b) II类转座子:
DNA转座子(DNA transposons),通过自身编码的转座酶直接切割转座子所在DNA序列,实现序列的转移。以睡美人转座子(SleepingBeauty)和PiggyBac转座子等DNA转座子最为常见。

PiggyBac转座子结构与作用机制

PB是一种II类转座元件,最初来源于卷心菜环蛾(Trichoplusia ni),它特异性靶向DNA中的TTAA四核苷酸位点,PB转座子长度为2472bp,由PB转座酶(PBase)基因组成,该基因两侧有转座所需的末端重复序列。

转座通过“剪切和粘贴”机制发生,在该机制中,PBase最初识别并结合转座子末端。然后,它将整个转座子从其原始位置切除,并通过一种不依赖于宿主因子的机制催化其插入另一个染色体位点。

PiggyBac双载体系统及优点
PB转座子衍生的双载体系统由(i)携带人工转座子的供体载体和(ii)驱动PBase表达的辅助载体组成,人工转座基因具有两侧为PB左右末端结构域的哺乳动物表达盒。使用PB系统获得哺乳动物细胞系有几个潜在的优点。
▶ 首先,供体和辅助载体的共转染可介导哺乳动物细胞中的高效外源基因整合,包括工业界常用宿主细胞系,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人类胚胎肾细胞(HEK293);
▶ 其次,PB整合位点的定位研究证明,PB有利于转座到宿主基因组的转录活性区域;
▶ 第三,已经表明PB转座子可有效介导高达14kbp的DNA转座至宿主中;
▶ 第四,PB转座可以整合目的基因的序列,从而降低非功能外源基因整合的概率;
▶ 最后,已经证明了使用PB系统可将单个或多个基因持续表达。


PiggyBac转座子双载体系统比传统的随机整合技术更有益于获得高产稳定的细胞株
PB双载体系统被用作外源基因递送载体,用于构建表达治疗性重组蛋白的稳定CHO细胞系。通过评估源自两种基因递送方法的克隆细胞系的生产力、长期稳定性和外源基因拷贝数进行比较:
1.PB转座子系统构建的稳定细胞系的效率高于传统质粒转染

PB双载体系统获得稳定细胞系的效率比传统质粒转染高出22倍(表I)。使用20%或更多pmPBase转染的细胞,在培养21天后观察到相近百分比的EGFP阳性细胞,表明转座酶达到饱和水平,超过该水平,稳定细胞系生成的效率没有提高。


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2.PB转座获得高表达的克隆概率高于传统质粒转染

以9:1的donor与helper质粒的比例进行研究,在10或50mg/mL嘌呤霉素中选择2周后,在对每个细胞池进行有限稀释,将单细胞铺板到96孔板中。在含有PBase[PB(10)和PB(50)]的条件下获得的克隆比无PBase时获得的克隆[TX(10)或TX(50)]具有更高的生产力(图3A)。在pmBPase存在的情况下,30-35%的克隆产量为50 mg/L或更高水平(图3B)。相反,在缺乏PBase的情况下没有一个克隆表达超过50mg/L(图3B)。


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3.PB转座子获得的细胞池及克隆中外源基因表达可维持长期的稳定性

以9:1的donor与helper质粒的比例进行研究,高或低选择时细胞池的差异约为六倍(表II)。在为期16周的稳定性研究中,没有观察到PB转座获得的细胞池产量的变化(图2)。16周内的变异系数PB(50)为17%和PB(10)为13%(表II)。

选择了上述克隆产量最高的四组进行稳定性研究。与细胞池获得的结果一样,通过PB转座获得的克隆在14周培养期内没有观察到产量的变化(图4),且平均体积生产率的变异系数<20%(表II)。通过PB转座获得的克隆细胞系在没有选择的情况下是稳定的。


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将上述16个克隆稳定性研究的开始(第1周)和结束(第14周)时收集的细胞通过1周分批培养的方式来分析细胞特异性生产力和生长。在第1周和第14周,通过PB转座获得的8个克隆的总比生产率平均为26 pg/细胞/天,比通过传统转染获得的细胞系的平均比生产率高3.3倍(图5)。

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澳门威尼克斯人官网的PiggyBac转座子双载体技术平台
PB转座的细胞池可获得更多的重组蛋白。PB转座获得高产单克隆的概率大、数量多,并且具有更高的体积生产力和外源基因拷贝数量。在没有选择的情况下,通过PB转座产生的细胞池和单克隆细胞系的体积生产力稳定长达3个月。PB转座可减少重组细胞系筛选的复杂程度及工作量,可应用于高表达稳定细胞株开发。澳门威尼克斯人官网根据项目需求,可采用PB系统进行细胞株构建及筛选。


参考文献

Mattia Matasci, Lucia Baldi, David L. Hacker, Florian M. Wurm .2011.The PiggyBac Transposon Enhances the Frequency of CHO Stable Cell Line Generation and Yields Recombinant Lines With Superior Productivity and Stability. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 108, No. 9, September, 2011 2141-2150


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